Як працює блокування білка?
По суті, ви застосовуєте інший білок, щоб увійти та зв’язатися з неспецифічними ділянками (місцями, які не є антигеном), так що реагент виявлення не може зв’язатися з ними. Сироватка є поширеним блокуючим агентом, оскільки антитіла, які вона містить, зв’язуються з неспецифічними ділянками. 19 лютого 2021 р.
Отже, мета кроку блокування полягає в тому, щоб зменшити кількість фону за рахунок неспецифічного склеювання. Зараз BSA складається лише з одного білка, BSA з вагою 60 кДа, тоді як молоко складається з багатьох білків, усі різного розміру. Таким чином, ви отримуєте набагато більше шансів зменшити більше фонових смуг.
Інгібітор синтезу білка – це сполука, яка зупиняє або уповільнює ріст або проліферацію клітин, порушуючи процеси, які призводять безпосередньо до генерації нових білків.
У цьому методі концентровані білкові буфери використовуються для конкуренції (або блокування) вашого антитіла від зв’язування з неспецифічними епітопами у вашому зразку. Ідея полягає в тому, що ваші антитіла не будуть зв’язуватися з вашими неспецифічними епітопами не краще, ніж ці неспецифічні білкові конкуренти.
Білковий вантаж рухається від ER до Гольджі, модифікується в Гольджі, а потім надсилається в різні місця призначення в клітині, включаючи лізосоми та поверхню клітини.. Гольджі обробляє білки, створені ендоплазматичним ретикулумом (ER), перш ніж відправити їх у клітину.
Блокувати більше 30 хвилин при кімнатній температурі не потрібно (3% знежирене молоко в TBST 0,1%). Зі свого досвіду я завжди вважав за краще досліджувати протягом ночі первинне антитіло при 4°C, а не продовжувати етап блокування.